Белок мидкин, выделяемый меланомой, формирует ниши для метастазов

Рис. 1. Общая схема пути, по которому меланома формирует метастазы в отдаленных лимфоузлах и органах. Вопреки ранее принятой точке зрения, этот процесс не включает формирование лимфатических сосудов в первичной опухоли и вокруг нее. Фактор роста клеток мидкин (MDK), продуцируемый опухолью, секретируется в свободной форме и в составе экзосом. Он достигает отдаленных пре-метастатических лимфоузлов и органов, в которых потом сформируются метастазы. Циркулирует ли мидкин в лимфе или/и в крови осталось неизвестным. Мидкин индуцирует лимфангиогенез в этих местах, что помогает подготовить их к прибытию раковых клеток. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Сконструированы линии лабораторных мышей, позволяющие проследить формирование новых лимфатических сосудов по всему организму. Показано, что фактор роста клеток мидкин, выделяемый меланомой, стимулирует этот процесс и подготавливает ниши для формирования метастазов далеко от опухоли. Полученные результаты могут позволить разработать новые маркеры для определения риска метастазирования, а также новые подходы для предотвращения и лечения метастазов.

Рак как причина смерти уверенно выходит на первое место в мире, а в ряде развитых стран уже занял эту позицию. Первичная раковая опухоль не так опасна: ее часто можно удалить хирургическим путем. Гораздо опаснее раковые клетки, которые разносятся по всему организму и могут развиться во вторичные опухоли (метастазы), иногда даже в очень отдаленных от первичной опухоли органах и тканях. Ведутся активные исследования с целью определить пути миграции раковых клеток по организму и блокировать образование метастазов. Эти проблемы пока не решены, и любой заметный шаг в их разрешении очень важен как с точки зрения теоретической, так и практической онкологии.

Меланома кожи представляет собой часто встречающееся агрессивное заболевание с очень ранней колонизацией лимфатических узлов раковыми клетками, которой предшествует активное формирование новых лимфатических сосудов (лимфангиогенез). Удаление первичной опухоли и близлежащих к ней лимфоузлов далеко не всегда продлевает жизнь пациента. Более того, в ходе прогрессии меланомы лимфатические сосуды опухоли спадаются и теряют свою функцию. Поэтому оставалось неясным, связан ли лимфангиогенез с метастазированием меланомы, а если связан, то как. Высказывалось предположение, что белки, секретируемые опухолью и/или ее стромой связаны с формированием ниш для метастазирующих клеток меланомы. Изучение роли лимфангиогенеза при меланоме и других злокачественных опухолях затруднялось тем, что не было подходящих экспериментальных животных для визуализации отдаленных пре-метастазных ниш.

Ученые во главе с Марией Соэнгас (María S. Soengas) из испанского Национального центра по изучению рака совместно с коллегами из еще нескольких медицинских и научных учреждений Испании и США сосредоточили усилия на прослеживании лимфангиогенеза по всему организму. Для этого они воспользовались известным свойством рецептора 3 фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor receptor 3, VEGFR3). Его экспрессия в клетках лимфатических сосудов в норме сильно подавлена, но она резко активируется при патологических состояниях, при воспалении и при раке. С помощью методов генетической инженерии авторы сконструировали линии модельных мышей, у которых ген флюоресцирующего белка люциферазы был поставлен под контроль промотора Vegfr3.

С помощью сенсора, регистрирующего флюоресценцию, они наблюдали рост лимфатических сосудов по всему организму мыши после пересадки им под кожу культивируемых клеток меланомы в зависимости от прогрессии метастазирования (рис. 2).

Рис. 2. Эмиссия люциферазы после трансплантации мышам клеток меланомы. Слева показаны мыши после трансплантации линий клеток меланомы с меньшим потенциалом к метастазированию, справа — с большим. Цифры на фото — дни после имплантации. Красным пунктиром обведены первичные опухоли. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Оказалось, что рост сосудов по различным отдаленным от места трансплантации участкам организма происходит независимо от их роста вокруг первичной опухоли. Следовательно, лимфангиогенез вокруг первичной опухоли не определяет метастатическую колонизацию раковых клеток в других органах и тканях. Более того, уровень экспрессии в опухоли фактора роста эндотелия сосудов С (VEGFС), который связывается с VEGFR3 и активирует его, не коррелировал с формированием отдаленных метастазов. То есть лимфангиогенез в отдаленных участках организма не связан с продукцией VEGFС опухолью.

Ранее уже было показано, что опухоль индуцирует формирование ниш для метастазов в отдаленных органах до того, как туда прибудут метастазирующие клетки. Если опухоль удалить, в этих нишах все равно могут образоваться метастазы. Авторы показали, что даже еще слабо развившиеся опухоли индуцировали экспрессию люциферазы в лимфатических узлах печени, селезенки и легких. Через некоторое время там образовывались метастазы. Удаление опухоли сопровождалось значительным снижением уровня люциферазы в пре-метастазных участках, но позже он мог опять возрасти, и впоследствии там формировались метастазы (рис. 3).

Рис. 3. Количественная оценка эмиссии люциферазы после трансплантации мышам клеток меланомы и удаления первичной опухоли (синими цифрами обозначены моменты: 1 — вживление опухоли, 2 — перед удалением первичной опухоли, 3 — после удаления, 4 — после обнаружения метастазов). Показаны данные для метастазов в лимфоузлах, легких и коже. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Эти данные показывают, что активация дистального лимфангиогенеза, индуцированная клетками опухоли, является индикатором формирования пре-метастазной ниши.

Поскольку оказалось, что VEGFС не является причиной отдаленного лимфангиогенеза и образования метастазов, авторы исследовали другие секретируемые опухолью факторы, которые могли быть связаны с этими процессами. С помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии они провели сравнение наборов пептидов, получающихся при расщеплении белков, секретируемых культурами меланомных клеток с разной способностью образовывать метастазы. Сравнение с каталогами «пептидных подписей» показало, что самым вероятным кандидатом на роль индуктора лимфангиогенеза является мидкин (MDK). Этот небольшой белок известен как Фактор роста клеток, в частности, стимулирующий рост кровеносных сосудов, но о его участии в лимфангиогенезе ранее не было известно.

Иммуногистологический анализ показал, что мидкин активно вырабатывается клетками меланомы с высоким потенциалом к образованию метастазов, и очень слабо — в клетках с низким потенциалом (рис. 4).


Рис. 4. Слева направо показаны гистологические препараты клеток трансплантированных мышам меланом с возрастающим потенциалом к метастазированию. Мидкин виден в виде красных прожилок и пятен. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Подавление экспрессии и секреции мидкина с помощью специально подобранной «шпилечной» РНК (shRNA) не влияло на экспрессию VEGFС или VEGFD. Более того, оно не влияло и на рост кровеносных сосудов в ксенографтных (вызванных меланомными клетками человека) опухолях. Но формирование лимфатических сосудов в них подавлялось. Наиболее яркий эффект подавления мидкина — прекращение люминесценции и образования метастазов в отдаленных лимфоузлах и органах (рис. 5). У мышей с подавленной экспрессией мидкина после удаления первичной опухоли метастазы не образовывались вообще. При этом усиление экспрессии мидкина, индуцированное введением в клетки лентивирусного вектора, несущего кодирующий мидкин ген, превращало клетки со слабым потенциалом к метастазированию в активно метастазирующие.

Рис. 5. Слева: эмиссия люциферазы (цвет обозначает интенсивность) после трансплантации мыши клеток меланомы. Использование специальных «шпилечных» РНК, выключающих ген, кодирующий мидкин, подавляют лимфангиогенез (показаны результаты применения двух из пяти использованных в работе таких РНК). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Культуральная среда клеток, активно выделяющих мидкин, стимулировала пролиферацию эндотелия лимфатических сосудов. А в организме мыши мидкин скапливался в формирующихся лимфатических сосудах (рис. 6). Это приводило к активации в эндотелии белка mTOR, стимулирующего пролиферацию. Кроме того, мидкин не только стимулировал лимфангиогенез, но и как таковой способствовал адгезии раковых клеток во вновь сформированных лимфатических сосудах.

Рис. 6. Мидкин (зеленый) скапливается в местах формирования новых лимфатических сосудов и их вхождения в лимфоузлы (показаны стрелками). Звездочками отмечены клетки стромы. Красным контрастированы лимфатические сосуды. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, проведенные исследования раскрыли механизмы, посредством которых секретирующая мидкин первичная опухоль меланомы вызывает рост лимфатических сосудов. Это, в свою очередь, приводит к формированию пре-метастазных ниш посредством до сих пор неизвестных процессов.

Ретроспективное исследование доброкачественных родинок и меланомы человека также показало связь экспрессии мидкина с клинической картиной заболевания. Для прооперированных пациентов, у которых в свободных от опухолевых клеток лимфоузлах наблюдался высокий уровень мидкина, прогноз длительности жизни без рецидивов оказался существенно хуже, чем для пациентов с низким уровнем мидкина.

Результаты обсуждаемой работы имеют большое значение и для теоретической, и для практической онкологии. Но ряд важных вопросов пока остался без ответа. Какими путями по кровеносным и/или лимфатическим сосудам мидкин попадает в отдаленные участки организма? Какой из рецепторов клеток эндотелия лимфатических сосудов связан с лимфангиогенезом? В какой мере результаты, полученные на меланоме, могут быть распространены на другие раковые опухоли?

С практической точки зрения мидкин и лимфангиогенез могут служить хорошими молекулярными и функциональными маркерами риска метастазирования. Лимфангиогенез и его драйверы (мидкин, mTOR и другие) могут стать мишенями для новых методов и средств предотвращения метастазирования.

Источники:
1) D. Olmeda et al. Whole-body imaging of lymphovascular niches identifies pre-metastatic roles of midkine // Nature. 2017. V. 546. P. 676–680.

2) A. Hoshino, D. Lyden. Metastasis: Lymphatic detours for cancer // Nature. 2017. V. 546. P. 609–610. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье.)

Вячеслав Калинин

Источник

Рис. 1. Общая схема пути, по которому меланома формирует метастазы в отдаленных лимфоузлах и органах. Вопреки ранее принятой точке зрения, этот процесс не включает формирование лимфатических сосудов в первичной опухоли и вокруг нее. Фактор роста клеток мидкин (MDK), продуцируемый опухолью, секретируется в свободной форме и в составе экзосом. Он достигает отдаленных пре-метастатических лимфоузлов и органов, в которых потом сформируются метастазы. Циркулирует ли мидкин в лимфе или/и в крови осталось неизвестным. Мидкин индуцирует лимфангиогенез в этих местах, что помогает подготовить их к прибытию раковых клеток. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Сконструированы линии лабораторных мышей, позволяющие проследить формирование новых лимфатических сосудов по всему организму. Показано, что фактор роста клеток мидкин, выделяемый меланомой, стимулирует этот процесс и подготавливает ниши для формирования метастазов далеко от опухоли. Полученные результаты могут позволить разработать новые маркеры для определения риска метастазирования, а также новые подходы для предотвращения и лечения метастазов.

Рак как причина смерти уверенно выходит на первое место в мире, а в ряде развитых стран уже занял эту позицию. Первичная раковая опухоль не так опасна: ее часто можно удалить хирургическим путем. Гораздо опаснее раковые клетки, которые разносятся по всему организму и могут развиться во вторичные опухоли (метастазы), иногда даже в очень отдаленных от первичной опухоли органах и тканях. Ведутся активные исследования с целью определить пути миграции раковых клеток по организму и блокировать образование метастазов. Эти проблемы пока не решены, и любой заметный шаг в их разрешении очень важен как с точки зрения теоретической, так и практической онкологии.

Меланома кожи представляет собой часто встречающееся агрессивное заболевание с очень ранней колонизацией лимфатических узлов раковыми клетками, которой предшествует активное формирование новых лимфатических сосудов (лимфангиогенез). Удаление первичной опухоли и близлежащих к ней лимфоузлов далеко не всегда продлевает жизнь пациента. Более того, в ходе прогрессии меланомы лимфатические сосуды опухоли спадаются и теряют свою функцию. Поэтому оставалось неясным, связан ли лимфангиогенез с метастазированием меланомы, а если связан, то как. Высказывалось предположение, что белки, секретируемые опухолью и/или ее стромой связаны с формированием ниш для метастазирующих клеток меланомы. Изучение роли лимфангиогенеза при меланоме и других злокачественных опухолях затруднялось тем, что не было подходящих экспериментальных животных для визуализации отдаленных пре-метастазных ниш.

Ученые во главе с Марией Соэнгас (María S. Soengas) из испанского Национального центра по изучению рака совместно с коллегами из еще нескольких медицинских и научных учреждений Испании и США сосредоточили усилия на прослеживании лимфангиогенеза по всему организму. Для этого они воспользовались известным свойством рецептора 3 фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor receptor 3, VEGFR3). Его экспрессия в клетках лимфатических сосудов в норме сильно подавлена, но она резко активируется при патологических состояниях, при воспалении и при раке. С помощью методов генетической инженерии авторы сконструировали линии модельных мышей, у которых ген флюоресцирующего белка люциферазы был поставлен под контроль промотора Vegfr3.

С помощью сенсора, регистрирующего флюоресценцию, они наблюдали рост лимфатических сосудов по всему организму мыши после пересадки им под кожу культивируемых клеток меланомы в зависимости от прогрессии метастазирования (рис. 2).

Рис. 2. Эмиссия люциферазы после трансплантации мышам клеток меланомы. Слева показаны мыши после трансплантации линий клеток меланомы с меньшим потенциалом к метастазированию, справа — с большим. Цифры на фото — дни после имплантации. Красным пунктиром обведены первичные опухоли. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Оказалось, что рост сосудов по различным отдаленным от места трансплантации участкам организма происходит независимо от их роста вокруг первичной опухоли. Следовательно, лимфангиогенез вокруг первичной опухоли не определяет метастатическую колонизацию раковых клеток в других органах и тканях. Более того, уровень экспрессии в опухоли фактора роста эндотелия сосудов С (VEGFС), который связывается с VEGFR3 и активирует его, не коррелировал с формированием отдаленных метастазов. То есть лимфангиогенез в отдаленных участках организма не связан с продукцией VEGFС опухолью.

Ранее уже было показано, что опухоль индуцирует формирование ниш для метастазов в отдаленных органах до того, как туда прибудут метастазирующие клетки. Если опухоль удалить, в этих нишах все равно могут образоваться метастазы. Авторы показали, что даже еще слабо развившиеся опухоли индуцировали экспрессию люциферазы в лимфатических узлах печени, селезенки и легких. Через некоторое время там образовывались метастазы. Удаление опухоли сопровождалось значительным снижением уровня люциферазы в пре-метастазных участках, но позже он мог опять возрасти, и впоследствии там формировались метастазы (рис. 3).

Рис. 3. Количественная оценка эмиссии люциферазы после трансплантации мышам клеток меланомы и удаления первичной опухоли (синими цифрами обозначены моменты: 1 — вживление опухоли, 2 — перед удалением первичной опухоли, 3 — после удаления, 4 — после обнаружения метастазов). Показаны данные для метастазов в лимфоузлах, легких и коже. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Эти данные показывают, что активация дистального лимфангиогенеза, индуцированная клетками опухоли, является индикатором формирования пре-метастазной ниши.

Поскольку оказалось, что VEGFС не является причиной отдаленного лимфангиогенеза и образования метастазов, авторы исследовали другие секретируемые опухолью факторы, которые могли быть связаны с этими процессами. С помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии они провели сравнение наборов пептидов, получающихся при расщеплении белков, секретируемых культурами меланомных клеток с разной способностью образовывать метастазы. Сравнение с каталогами «пептидных подписей» показало, что самым вероятным кандидатом на роль индуктора лимфангиогенеза является мидкин (MDK). Этот небольшой белок известен как Фактор роста клеток, в частности, стимулирующий рост кровеносных сосудов, но о его участии в лимфангиогенезе ранее не было известно.

Иммуногистологический анализ показал, что мидкин активно вырабатывается клетками меланомы с высоким потенциалом к образованию метастазов, и очень слабо — в клетках с низким потенциалом (рис. 4).


Рис. 4. Слева направо показаны гистологические препараты клеток трансплантированных мышам меланом с возрастающим потенциалом к метастазированию. Мидкин виден в виде красных прожилок и пятен. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Подавление экспрессии и секреции мидкина с помощью специально подобранной «шпилечной» РНК (shRNA) не влияло на экспрессию VEGFС или VEGFD. Более того, оно не влияло и на рост кровеносных сосудов в ксенографтных (вызванных меланомными клетками человека) опухолях. Но формирование лимфатических сосудов в них подавлялось. Наиболее яркий эффект подавления мидкина — прекращение люминесценции и образования метастазов в отдаленных лимфоузлах и органах (рис. 5). У мышей с подавленной экспрессией мидкина после удаления первичной опухоли метастазы не образовывались вообще. При этом усиление экспрессии мидкина, индуцированное введением в клетки лентивирусного вектора, несущего кодирующий мидкин ген, превращало клетки со слабым потенциалом к метастазированию в активно метастазирующие.

Рис. 5. Слева: эмиссия люциферазы (цвет обозначает интенсивность) после трансплантации мыши клеток меланомы. Использование специальных «шпилечных» РНК, выключающих ген, кодирующий мидкин, подавляют лимфангиогенез (показаны результаты применения двух из пяти использованных в работе таких РНК). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Культуральная среда клеток, активно выделяющих мидкин, стимулировала пролиферацию эндотелия лимфатических сосудов. А в организме мыши мидкин скапливался в формирующихся лимфатических сосудах (рис. 6). Это приводило к активации в эндотелии белка mTOR, стимулирующего пролиферацию. Кроме того, мидкин не только стимулировал лимфангиогенез, но и как таковой способствовал адгезии раковых клеток во вновь сформированных лимфатических сосудах.

Рис. 6. Мидкин (зеленый) скапливается в местах формирования новых лимфатических сосудов и их вхождения в лимфоузлы (показаны стрелками). Звездочками отмечены клетки стромы. Красным контрастированы лимфатические сосуды. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, проведенные исследования раскрыли механизмы, посредством которых секретирующая мидкин первичная опухоль меланомы вызывает рост лимфатических сосудов. Это, в свою очередь, приводит к формированию пре-метастазных ниш посредством до сих пор неизвестных процессов.

Ретроспективное исследование доброкачественных родинок и меланомы человека также показало связь экспрессии мидкина с клинической картиной заболевания. Для прооперированных пациентов, у которых в свободных от опухолевых клеток лимфоузлах наблюдался высокий уровень мидкина, прогноз длительности жизни без рецидивов оказался существенно хуже, чем для пациентов с низким уровнем мидкина.

Результаты обсуждаемой работы имеют большое значение и для теоретической, и для практической онкологии. Но ряд важных вопросов пока остался без ответа. Какими путями по кровеносным и/или лимфатическим сосудам мидкин попадает в отдаленные участки организма? Какой из рецепторов клеток эндотелия лимфатических сосудов связан с лимфангиогенезом? В какой мере результаты, полученные на меланоме, могут быть распространены на другие раковые опухоли?

С практической точки зрения мидкин и лимфангиогенез могут служить хорошими молекулярными и функциональными маркерами риска метастазирования. Лимфангиогенез и его драйверы (мидкин, mTOR и другие) могут стать мишенями для новых методов и средств предотвращения метастазирования.

Источники:
1) D. Olmeda et al. Whole-body imaging of lymphovascular niches identifies pre-metastatic roles of midkine // Nature. 2017. V. 546. P. 676–680.

2) A. Hoshino, D. Lyden. Metastasis: Lymphatic detours for cancer // Nature. 2017. V. 546. P. 609–610. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье.)

Вячеслав Калинин

Источник

Leave a Reply